近年来跟着今世医学查究时间的前进和CTC临床使用价钱凸显，很多查究机构和研发团队都正在推出差异的CTC检测时间。因为血液中CTC的含量极低，目前主流的检测手腕是先搜捕（富集）后检测，少量手腕是不搜捕（富集）直接检测。CTC检测时间网罗CTC的富集（离散）和CTC的剖判审定（识别）。本篇著作将先容CTC的富集和剖判手腕，越发核心先容CTC的富集手腕。

　　人体轮回体例中CTC的含量极低，肿瘤变更患者每毫升全血中仅有1～10个CTC，因而要告终CTC的检测对其举办分选富集是一个症结的次序。CTC分选富集功效的优劣将会直接影响其后续的检测功效，因而高纯度、高聪明性（不失落CTC）、神速、高细胞活性的CTC分选富集是CTC临床使用的核心和难点。

　　CTC的富集手腕可能分为生物化学特征富集法（亲和性富集法）和物理特征富集法。亲和性富集法紧假使凭据通细致胞表表特异性表达的卵白质生物象征物离散靶细胞，网罗正向搜捕CTC的阳性富集法和负向去除白细胞的阴性富集法。物理特征富集法紧假使凭据CTC的巨细、密度、力学和介电功能等物理特征将CTC筛选出来。

　　亲和性富集法凭据连结的靶细胞是CTC照旧白细胞，可分为阳性富集法和阴性富集法。阳性富集法紧要行使特异性抗体与肿瘤细胞表表抗原举办特异性连结来富集CTC。CTC分为上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮间质细胞羼杂表型，因而用于CTC阳性富集的特异性抗体分为识别上皮象征物、识别间质象征物和识别上皮间质象征物三种。此中，上皮象征物正在寻常上皮细胞和上皮肿瘤（即癌）上表达，但正在间质白细胞上不存正在，因而常常用于分别癌细胞和寻常血细胞。上皮细胞粘附分子（EpCMA）是最常用于上皮表型CTC阳性富集的细胞表表象征物。另表，因为细胞骨架卵白对付上皮细胞拥有特异性，细胞角卵白家族成员（即CK8，CK18和CK19）一经成为检测拥有上皮表型癌症患者CTC的“金圭表”记号物。阴性富集法也称白细胞去除法，通俗用识别CD45或CD14的特异性抗体与白细胞连结，从而去除全血中的白细胞。

　　除了特异性抗体，亲和性结富集法的某些时间采用与CTC或白细胞表表抗原特异性连结的多肽或适配体（aptamer，一种单链DNA或RNA分子，与宗旨卵白有很高的亲和力和特异性）取代抗体来告终阳性或阴性富集。

　　亲和性富集法目前基于免疫磁珠时间和微流控芯片时间对CTC举办富集。免疫磁珠时间是凭据免疫亲和的道理，将免疫磁珠与搜捕抗体或特异性多肽（可与血液中的CTC或白细胞表表抗原相连结）相衔接，随后通过磁场即可将磁珠搜捕与未搜捕的细胞离散。

　　微流控（microfluidics）是一种准确局限和操控微标准流体，以正在微纳米标准空间中对流体举办操控为紧要特色的科学时间。微流控芯片是微流控时间告终的紧要平台和时间装配，因其样品量幼、流速可控及构件透后性等特征，已被通常使用于CTC的分选富荟萃。微流体芯片时间基于亲和性富集法离散CTC时，芯片内部的微通道或微构造上装点也许与CTC或白细胞表表抗原连结的特异性抗体或适配体，当血液流经芯片时，特异性抗体或适配体可与宗旨细胞表表抗原连结，随后将CTC或白细胞粘附正在芯片上，告终CTC的阳性搜捕或阴性富集。

　　物理特征富集法凭据物理性子来离散CTC，网罗巨细、密度、力学和介电性子。从巨细上来看，CTC的直径约为10-20μm，而血细胞巨细为7-12μm，通过过滤可留积较大的CTC。从密度上来看，CTC的密度较白细胞和红细胞密度幼，通过密度梯度离心可告终CTC离散。除了巨细和密度的分别，少许时间也行使CTC和血细胞之间的力学和介电性子分别来搜捕CTC。完全来说，CTC的可变形性不足血细胞。其余，CTC的膜电容通俗较血细胞低，正在肯定强度的电场中，其转移率与血细胞会出现分别。微流控时间除了正在亲和性富集法中有通常使用表，正在物理特征富集法中也有使用。微流控芯片凭据CTC与血细胞物理特征的分别，通过正在芯片中修树差异的微构造单位将其从血液平离散出来，常用的微构造网罗微孔、微过滤网和微柱等。

　　另表，也有少许时间将CTC的物理和生物化学特征连结起来用于CTC富集。如CTC-iChip，其基于CTC巨细和表表象征物的表达状况举办CTC富集。该时间最先凭据细胞巨细，将较幼的红细胞和血幼板过滤出去，留下白细胞和肿瘤细胞。然后，用识别EpCAM的磁珠偶联抗体对CTC举办免疫染色，正在磁场中搜捕并征求正在芯片上。或者用识别CD45的磁珠偶联抗体去除白细胞后征求CTC。

　　从时间进展史来看，CTC富集时间分为三代：第一代为基于物理特征的粗离散时间，第二代为基于生化特征的免疫磁珠时间，第三代为基于物理或生化特征的微流控芯片时间。

　　基于物理特征的粗离散时间通过特地滤膜装配、密度梯度离心将CTC离散出来。这些时间操作容易本钱低廉，不依赖细胞表表抗原的表达，搜捕的细胞数目多，然则因为CTC物理特征的异质性，难以富集到高纯度的CTC。

　　基于生化特征的免疫磁珠时间通过免疫磁珠偶联的抗体或多肽正向或负向筛选出CTC。因为时间的局限，早期的磁珠只可抵达微米级。跟着纳米时间的进展，现正在操纵的磁珠多数为纳米级，其增大的比表表积增添了与待测细胞的接触几率，更好的阔别性低落了对细胞变成的呆滞性压力，大大升高了CTC的富集率。最模范的基于免疫磁珠富集CTC的时间平台是强生子公司veridex的CellSearch，其是环球目前独一同时进程FDA和CFDA允许的用于CTC检测的贸易化产物。该产物因为检测聪明度不高，且无法离散活体CTC，2016年头已停产。除了CellSearch以表，也有多种时间平台基于免疫磁珠时间搜捕CTC，如AdnaGen公司（已被Qiagen收购）的AdnaTest，Miltenyi公司的MACS，Illumina公司的MagSweeper。

　　（A）将血液吸入含有EDTA和细胞包庇剂的CellSave包庇管中;（B）将7.5mL血液变更到零丁的管中并离心以离散固体血液因素和血浆;（C）样品放入CELLTRACKS®AUTOPREP® 体例中，吸出血浆并将样品重悬于缓冲液中;（D）增加偶联EpCAM抗体的磁性纳米颗粒并与EpCAM阳性细胞连结，从而“富集”上皮来历的CTC。然后将磁珠连结的细胞与其他细胞通过磁性离散;（E）CTC用CK8，CK18和CK19抗体染色。CD45阳性染色细胞被以为是白细胞，并被消释正在剖判以表;（F）使用DAPI染色细胞核;（G）施加磁力以离散磁珠连结的EpCAM阳性细胞;（H）CK阳性、DAPI阳性、CD45阴性的细胞被以为是CTC用于进一步剖判。

　　微流控芯片时间基于CTC的物理特征或生化特征或两种特征的连结来富集CTC，所需样品量幼、流速可控并且也许搜捕活细胞。微流控芯片时间目前一履历了三代的进展流程：第一代芯片为以CTC-Chip为代表，第二代芯片以HB-Chip为代表，第三代芯片以CTC-iChip为代表。

　　该类芯片基于CTC与血细胞生化特征的分别，正在芯片中修树微柱阵列将其从血液平离散出来。此类芯片以CTC-Chip为代表，该芯片是第一个操纵微流体时间富集CTC的装配。CTC-Chip由78,000个微柱阵列构成，微柱被识别EpCAM的抗体包被，微柱的几何摆列和流体流速被优化以鼓舞细胞附着到抗体包被的柱上。除了CTC-Chip，也有少许公司拓荒基于微柱构造的芯片富集CTC，如Captura公司的GEDI-Chip，Biocept公司的OncoCEE。基于微柱构造的芯片因为庞大的微柱策画很难正在大范畴的根本进取行高通量坐蓐。另表，目前用于CTC检测和表征的时间要紧依赖于免疫细胞化学和必要高区分率成像的其他时间，这正在非透后三维微柱阵列的存鄙人是障碍的。

　　因为基于微柱构造的芯片的部分性，表表搜捕的微流体芯片被拓荒，这些芯片操纵抗体包被的表表装配搜捕CTC。表表搜捕装配的简化架构更适合于大范畴坐蓐，而且还答允修造更易于成像的透后装配。此类芯片以HB-Chip为代表，其微流道的构造为鱼骨形（HB），表表被识别EpCAM的抗体包被，血液流过一个可视通道，通道内鱼骨形沟回也许惹起血液的一个微幼斡旋，从而巩固了其与抗体装点表表的接触。与第一代CTC芯片比拟，第二代的HB芯片修造更为容易，且可更高效地搜捕肿瘤细胞，搜捕效能约90%。后人正在第二代的根本上加上了aptamer（连结CTC表表的EpCAM），进一步升高了CTC的搜捕效能。除了HB-Chip，GEM-Chip、GO-Chip以及BioFluidica公司的ModularSinusoidal Microsystem也都采用表表装配搜捕CTC。操纵表表搜捕装配的一个寻事是下游管理的活络性，搜捕的CTC被固定正在装配的表表上，而且难以光复以举办进一步剖判。正在胰卵白酶消化后可能开释正在这些装配中搜捕的细胞，然而胰卵白酶很不妨切割用于后续剖判的很多感风趣的表表受体。

　　目前一经有多家公司或查究单元使用免疫磁珠时间来处置表表搜捕装配的部分性，该时间能很好地局限细胞搜捕与开释。此类芯片以CTC-iChip为代表，该芯片将免疫磁珠和微流控时间连结起来用于CTC富集。CTC-iChip最先操纵塑料微柱阵列将幼个的红细胞和血幼板过滤出去，然后正在磁场中通过“惯性聚焦”用意将较大的细胞排成一行，并操纵阳性或阴性富集手腕离散CTC与白细胞。CTC-iChip的搜捕效能可能高达98%，然则对付直径较幼（8微米）的CTC并分歧用。除了CTC-iChip，也有多种芯片时间操纵免疫磁珠富集CTC。如Ephesia公司的Ephesia，Cynvenio公司的LiquidBiopsy，Fluxion公司的Isoflux，这些芯片的搜捕效能与第二代芯片邻近，为90%安排。

　　上述芯片紧要基于CTC的生化特征将其从血液平离散出来，拥有特异性高的甜头，能有用分选形态、巨细肖似的差异品种细胞。目前大个人时间采用EpCAM动作CTC的表表特异性抗原，然则正在差异的肿瘤亚型中，EpCAM的表达各纷歧样。依赖EpCAM的CTC分选芯片会失落不表达或低表达EpCAM的CTC，然而这些CTC拥有更大的浸润性和侵入性。因而，缺乏公认的表表象征物局限了亲和性富集正在CTC分选中的使用。

　　为了无需依赖表表象征物，也有少许微流控芯片基于物理特征富集CTC，目前紧要有基于细胞巨细和变形性分此表芯片时间，基于细胞力学性子的芯片时间和基于细胞介电性子的双向电泳时间。

　　该时间通过正在芯片内部策画差异的幼于CTC直径的微孔、微过滤网、微柱等构造，当含有CTC的样品流经芯片时，CTC因为直径大而被卡正在构造内，血细胞则随缓冲液沿道流出，较大的白细胞被构造搜捕时，因为CTC比白细胞变形性幼，加大缓冲液流速时，白细胞被冲走，CTC则留正在芯片内，从而抵达离散宗旨。Abnova公司的ClearCell®CXSystem即是基于此道理离散CTC的代表，该体例还可能动态监测CTC的搜捕流程。芯片紧要构造由圆柱形微柱组成，每个搜捕单位由三个圆柱摆列构成一个“爪形”构造。

　　基于细胞巨细和变形性分别分选CTC的上风正在于：操作流程容易，搜捕效能高，也许告终高通量富集，本钱远远低于CellSearch，无需依赖表表象征物，分选出的CTC可能用多种抗体举办象征物鉴识。该手腕存正在的题目是仅仅基于细胞尺寸和变形性差异而举办过滤式分选，因为CTC尺寸和白细胞有重叠个人，CTC有不妨会通过滤网或微柱的间隔；并且正在较大的呆滞力用意下，CTC跟着缓冲液流过微柱或者滤网时容易分割。这些要素会对离散纯度和细胞活性变成肯定影响，这类芯片正在策画内部搜捕单位时应避免操纵带棱角的微柱，比方三角形、长方形、正方形等。

　　基于细胞力学性子的芯片时间：这些时间紧要基于惯性力或确定性侧向位移。基于惯性力的惯性微流时间通过操纵两种力（梯度剪切升力和管壁效应升力）正在微流体装配中使用惯性效应，基于尺寸被动地将CTC与其他血细胞离散。这些升力的巨细和目标取决于通道尺寸，通道纵横比，流速和颗粒直径。目前该时间的贸易化平台紧要有Vortex（直线型通道）和ClearCellFX（单螺旋通道）。

　　基于确定性侧向位移策画的微流控芯片道理是芯片内拥有相对付流体滚动目标呈肯定角度的微柱阵列，尺寸差异的颗粒正在滚动流程中拥有差异的运动轨迹，尺寸大的颗粒会发作侧向位移向一侧集聚，尺寸幼的颗粒会按原轨迹运动，正在芯片上策画相应的两个出口，即可征求到相应的细胞。

　　基于细胞力学性子分别分选同基于细胞巨细和变形性分别分选一律，装配容易、无需庞大的尝试修立、本钱低。样品无需记号，不影响CTC分子特征和表表象征物；细胞正在微流处境中毁伤幼，分选后细胞的存活率更高，可陆续作育和做后续剖判。然而，因为血液的庞大性，细胞间的互相用意阻挡易局限，当管理细胞浓度较高的样品时，分选效能低落。其余，该手腕纯净基于细胞的物理特征告终，而人体血液是高度庞大的血浆、红白细胞、血幼板、卵白质羼杂物，且血液黏度是水的3倍以上，因而芯片有时容易发作断绝景象，影响分选效能，分选出的CTCs不妨存正在假阳性结果。

　　双向电泳（DEP）是微流控芯片上一种常用的细胞分选手腕，其道理是差异类型的细胞正在电场中介电性子差异，所受介电力的巨细和目标差异，正在差异介电力用意下向差异目标转移，正在电场中告终宗旨细胞的分选。目前，贸易化的双向电泳时间紧要有ApoCell公司的ApoStream，SiliconBiosystems公司的DEPArray。

　　双向电泳法最大的上风是可将差异癌种表表象征物表达一样、尺寸肖似、样子肖似的细胞离散出来。然则正在较大的流速下，单薄的电泳力没有弥漫功夫感触流过的CTC，从而难以抵达神速分选。该手腕存正在的另一个题目是电场力不妨会对细胞活性和表表特征出现影响，晦气于对CTC举办后续作育和分子特征剖判。双向电泳法分选功夫长，但确凿率高，因而，较适合于少量细胞的分选。

　　微流控芯片时间因为其自己特征正在细胞分选方面拥有肯定的上风，网罗芯片体积幼、速率速、通量高、操作浅易、样品和试剂破费低、易正在芯片上集成多用处功效部件等．进程十多年的进展，该时间一经正在CTC分选中越来越通常的使用，希望正在改日成为CTC富集和检测用具之一。该时间目前也面对着少许时间上和临床上的寻事：芯片通道空间幼，尝试流程中管道容易被断绝；有些特地的芯片造价腾贵未便于扩充使用；正在举办细胞分选时，有些手腕难以确保较高的细胞活性；缺乏团结的CTC表表象征物等．怎么修正微流控芯片时间正在举办细胞分选时所碰到的上述题目，满盈阐扬其上风，将是接下来查究的症结。

　　CTC检测的聪明度和牢靠性异常首要，7.5ml血液中有1～5个CTC正在临床上都是无旨趣的，假阴性和假阳性都不妨对样品剖判、临床诊断出现首要影响。跟着纳米时间的不竭进展，功效化纳米原料装点的微流控芯片通常使用于CTC的富集和检测。抗体衔接的功效性纳米粒子也许为CTC与抗体的连结供应更大的接触表表积，因而纳米时间也成为细胞分选中备受注视的一项新时间。适配体能供应特异性CTC靶点，因而微流控芯片的使用也许可能向基于新的CTC搜捕探针（如核酸适配体探针等）方面进展，寻找特异性强的适配体探针，以升高CTC检测的牢靠性。

　　亲和性富集法特异性高，能有用分选形态、巨细肖似的差异品种细胞，然则阳性富集法多数操纵EpCAM，会失落不表达或低表达EpCAM的CTC，而阴性富集法只是去除了白细胞，CTC纯度不高。物理特征富集法不依赖细胞表表象征物的表达，搜捕的细胞数目多，也许战胜CTC正在卵白表达上的异质性，然则无法战胜CTC正在物理特征的异质性。因而，采用多种搜捕手腕相连结，满盈行使各自的甜头策画CTC搜捕微流控芯片是改日的进展趋向。如第三代芯片CTC-iChip，其行使确定性侧向位移、惯性聚焦和免疫磁珠富集CTC。

　　表洋CTC公司正在粗离散时间、免疫磁珠时间和微流控时间等方面均有组织，并且微流控时间使用较多。这评释表洋CTC公司紧随时间进展趋向，希望升高CTC的搜捕效能并将CTC检测神速使用于临床。

　　目前国内举办CTC检测的公司约莫有20多家。与表洋公司仿佛，国内公司正在粗离散时间、免疫磁珠时间和微流控时间等方面均有组织。然而差异的是，国内公司基于生化特征的富集手腕紧假使免疫磁珠时间，微流控时间使用较少，而基于物理特征的富集手腕紧假使微流控时间。这评释正在微流控芯片时间方面，国内公司的使用水准低于表洋公司。微流控芯片时间动作目前CTC搜捕时间进展的紧要趋向，不妨会对国内液体活检公司带来一场时间改进和升级。除了自立研发，国内多家公司一经与表洋公司告终时间引进或配合拓荒公约：博奥晶典和新加坡液体活检公司Celsee配合独家引入后者的CTC检测时间平台；丽珠集团与美国Cynvenio公司合伙组修了专一于液体活检的丽珠圣美；贝达药业与美国CapioBiosciences公司配合，引入了OncoSenseCTC搜捕时间。由此可见，国内CTC公司仍必要紧跟时间进展趋向，不竭研发CTC富集时间，升高细胞的搜捕效能和纯度。

　　行使亲和特征或物理特征法可富集到CTC，接下来还必要连结有用的下游剖判手腕。一方面，因为目前CTC搜捕时间不行包管百分之百的纯度，必要对所获得的细胞举办审定，以进一步确定CTC细胞的数量，以裁减CTC数量判决的假阳性率和假阴性率。另一方面，正在肿瘤的发作进展流程中，不但CTC的数量正在动态的改观，CTC所率领的分子象征物也正在改观，通过对CTC表表象征物检测，也许反响肿瘤发作进展的动态改观，是查究肿瘤发作进展机造的有用政策，并能很好地诱导临床疗养。常用的CTC剖判时间如免疫荧光、PCR、FISH及高通量测序等。

　　因为血液中CTC的含量极低，目前主流的检测手腕是先搜捕（富集）后检测，少量手腕是不搜捕（富集）直接检测。CTC的富集手腕紧假使基于其生化特征或物理特征或两种特征的连结，一履历了三代的进展进程。微流控芯片时间仰仗多种上风一经正在CTC分选中获得越来越通常的使用，希望正在改日成为CTC富集和检测用具之一。但该时间也面对着少许时间上和临床上的寻事，必要战胜这些题目并满盈阐扬其上风。同时也必要采用多种搜捕手腕相连结，满盈行使各自的甜头策画CTC搜捕微流控芯片。与表洋公司比拟，国内公司必要紧跟时间进展趋向，加大微流控芯片时间正在CTC富集方面的使用。