人类皮质器官构造是一种三维神经元作育物，正正在成为研讨大脑发育和功效波折的有力器材。然而，有机体能否正在功效上衔接体内的感到搜集另有待证据。正在这里，咱们连系透后微电极阵列和双光子成像时间，对移植到成年幼鼠后脾皮层的人类皮质类器官举行纵向、多形式监测。双光子成像显示了移植的类器官的血管化。视觉刺激会唤起类器官的电心理反响，与周遭皮层的反响相完婚。多单元营谋（MUA）和伽马功率的加多以及刺激诱发的 MUA 与慢振荡的锁相显示了类器官与宿主大脑之间的功效整合。免疫染色证据了人鼠突触的存正在。将透后微电极植入类器官是一种多功效体内平台，可用于一切评估幼鼠脑内人类神经元搜集的发育、成熟和功效整合。

　　干细胞时间的最新希望发作了人类皮质器官构造，这是一种由瓦解的人类诱导多伶俐细胞（hiPSCs）衍生的三维神经元搜集，可再现大脑皮层的某些特质。这一世物工程希望希望成为下一代疾病模子、药物筛选和特性化医疗平台，以及可移植的神经假体，以规复特定的缺失、退化或受损脑区。先前的研讨标明，作育皿中的皮质器官构造拥有与胎儿和出生后人类皮质发育相完婚的表达谱，况且器官构造能发作与再生儿脑电一样的电心理搜集营谋。与二维神经元作育物比拟，皮质器官构造显露出杂乱的神经元构造特质，如皮质层和更高的细胞类型多样性。与动物模子比拟，皮质器官构造保存了人类患者的遗传后台。其余，近来有研讨呈报称，正在体内植入幼鼠皮质的器官构造能够确立移植体的功效性血管，为移植体供给养分和氧气，防范器官构造重点细胞坏死，并将轴突突起延迟到周遭的宿主构造。

　　即使这些远景宏壮的研讨为体内类器官研讨奠定了根柢，但它们紧要蚁合正在对来自少量细胞的神经营谋举行局限和急性丈量。移植到成年受体中的类器官对表界感官刺激发作的慢性功效反响另有待证据。这须要对移植器官构造的构造和电心修生长举行纵向研讨。现有的记及时间目前局部了这种多形式试验的可行性。为了填补这一时间空缺，咱们开垦了一种基于光学透后石墨烯微电极时间的试验范式，用于纵向、多模态监测持久植入幼鼠大脑后脾皮层的人类神经元搜集的发育、成熟和功效整合。咱们诈骗清楚的幼鼠正在后脾皮层内举行慢性植入，映现了大脑皮层有机体和周遭构造对视觉刺激的电反响纵向记实，以及有机体血管化的光学成像。这些纵向多模态记实使咱们可能研讨神经营谋正在类器官/皮层鸿沟的传达、对类器官发作的感到刺激的功效反响以及周遭皮层神经营谋对移植类器官细胞尖峰营谋的调整。咱们举行了尸体构造学判辨，研讨了人的类器官与周遭幼鼠皮层的样子整合和突触衔接。其余，咱们还扩展了这一模范，研讨了植入的类器官和宿主皮层对麻醉反响的区别。咱们的事业供给了一种怪异的多形式本领，用于研讨类器官营谋的演变及其正在体内成熟流程中与周遭皮层的功效整合。咱们的事业将为异日研讨功效整合的类摊平道途，这些研讨将聚焦于类器官的通俗科知识题和潜正在临床使用。

　　石墨烯微电极的光学透后性可将电记实与多光子成像和光遗传刺激无缝连系。咱们行使透后石墨烯微电极阵列将异种移植皮质类器官和周遭宿主皮质的电记实与光学成像连系起来。微电极阵列有十六个 100 微米的电极片，间距 500 微米，笼盖面积为 2 毫米×2 毫米（图 1a）。植入前，咱们举行了电化学阻抗谱判辨（图 1b、c）；1 kHz 时的均匀阻抗约为 1.4 MΩ。为了举行植入，咱们将微阵列的反面粘合到由两个 3 毫米盖玻片和一个 5 毫米盖玻片构成的玻璃塞上。图 1d 概述了皮质器官构造的天生和植入事业流程。hiPSCs 服从之前安排的计划4 瓦解并麇集成三维作育物。天生 7-9 周后，凭据巨细和体式采取单个皮质类器官举行植入。凭据咱们之前的事业9，咱们将左侧脾后皮质（RSC）行为植入部位。RSC下有汇集的血管搜集9，这加多了异种的血管化大概性。咱们行使成年（8 到 12 周大）的 NOD/SCID 幼鼠行为受体。装置好钛头柱后，咱们正在目的区域移除一块约 3 × 3 毫米的头骨和硬脑膜。正在避开大动脉和静脉的处境下，咱们抽取了约 1 立方毫米的皮层，将单个皮层类器官放入空位中，并将石墨烯微电极阵列/玻璃组件放正在上面，以闭上展现（图 1e）。动物正在家养笼中时，阵列导线g）；记实流程中取下帽子（图 1f，下图）。通过 1 周的规复期后，每 2 周对 6 只幼鼠举行一次电心理记实，共接续 8-11 周。大大都微电极阻抗正在研讨时刻维系稳固（增加图 1）。图 2a 显示了一只拥有代表性的动物正在植入 69 天后的展现处境；正方形记号的是石墨烯电极垫。赤色勾画出异种移植，与周遭皮层比拟，显示出微幼的没落和变色。

　　图1 a 透后的 16 通道石墨烯微电极阵列，是植入 8 只动物体内的 8 个阵列的代表。b 拥有代表性的石墨烯微电极阵列的电化学阻抗光谱；迹线代表统一阵列的各个通道。d 从皮肤成纤维细胞中天生人类诱导多伶俐细胞（hiPSCs）；作育 hiPSC 衍生的类器官作育物以植入幼鼠皮层。e 有机体（Org）植入名望和微电极阵列（橙色）与后脾皮层（RSC）和视皮层（VIS）的名望干系。f 装置了维持帽的头柱成绩图（上图），以及固定正在支架长举行记实的头柱去掉维持帽后的成绩图（下图）。g 头柱和维持帽正在原笼中的幼鼠。

　　图 2：类器官和大脑皮层的刺激诱发局限场电位记实a 类器官植入部位（赤色轮廓）和周遭皮层的显微照片。石墨烯微电极阵列的电极垫特出显示；赤色通道被视为 “类器官通道”，而蓝色和玄色通道则笼盖宿主皮层。b 正在对侧眼受到 100 毫秒脉冲、2 赫兹、4 秒钟的视觉刺激时（橙色条），记实局限场电位（LFP）的单次试验，同时行使白色 LED。c LFP 响应的试验均匀值（20 次试验的均匀值 ± sdv）。d 彩色图显示对第一个光脉冲的反响的峰值振幅（顶部）和峰值延迟（底部），如图 c 所示。e 反响的频谱图（32-150 Hz）（20 次试验的均匀值）。插图：器官（通道 1）和视觉皮层（通道 2）重叠通道的放大频谱图（1-150 Hz）。b-e 面板中显示的记实是正在 69 dpi 时举行的；显示的结果代表了总共五只动物的结果。

　　咱们开始采用纵向多模态监测本领，通过施加视觉刺激并记实随后的电反响，研讨有机体是否能对感官刺激发作功效反响。咱们假设，当有机体与视觉皮层宿主构造整合后，它们将入手下手对视觉刺激发作功效营谋。刺激惹起的电反响是通过安插正在动物右目下的光纤耦合白光 LED 发出的光脉冲惹起的。正在悉数试验流程中，咱们阅览到正在类器官植入 3 周后至试验终止的记实中，类器官上方的电极通道确实展示终局限场电位（LFP）（n = 6 只动物，增加图 2）。图 2 显示了正在幼鼠皮层植入类器官 69 天后举行的一次试验的代表性结果。图 2a 显示的是植入部位的明视野图像。植入类器官上的六个电极通道用赤色标出。正在周遭皮层上的通道中，最亲近视觉皮层的通道用蓝色记号。其余电极（玄色）笼盖正在皮层与上矢状窦和横窦鸿沟邻近的构造上。图 2b-e 显示了以 2 Hz 频率发出 100 毫秒光脉冲接续 4 秒钟的记实结果（低通滤波，250 Hz）。正在每个光脉冲入手下手时，LFP 听命相似的双相体式。笼盖类器官的通道（赤色）显示出视觉刺激反应，而正在亲近视觉皮层的通道（蓝色）测得的反应最强。图 2c 显示了整个 16 个通道对光刺激的均匀 LFP 反响。LFPs 正在皮层/类器官鸿沟显露出连气儿性，显示出从最亲近视觉皮层的区域入手下手向植入类器官扩展的传达形式（图 2d）。类器官的 LFP 反响与周遭皮层的 LFP 反响相似，况且从皮层到类器官的 LFP 不间断传达标明记及时存正在功效衔接。如图 2 所示，类器官通道中的 LFPs 正在较晚的记及时段（50 dpi）最强，正在植入后 3 周驾御展示，当时举行了初次包蕴光刺激的记实（增加图 2）。

　　行使 Morlet 幼波举行的频谱判辨标明，正在视觉刺急流程中，皮层和类器官通道正在几个频率上的信号功率都有所加多（图 2e）。开始，咱们阅览到刺激频率及其二次谐波处的信号功率加多，这与之前正在幼鼠、猫和人的完备皮层中描画的功效营谋相似。其次，视觉光刺激导致伽马（30-150 Hz）功率加多，这与之前正在体内幼鼠完备视觉皮层中的研讨结果相似。完全来说，咱们阅览到 60-100 Hz 处的功率加多，这与单个刺激的入手下手时期相吻合。值得属意的是，与植入的类器官重叠的通道也展示了伽马反应，因为高频信号正在脑构造中的传达削弱，伽马反应被以为是一种更局限的丈量本领（图 2e）。高伽马频率周围（100 Hz）的 LFP 被以为与局限尖峰营谋亲密联系。正在对猕猴的研讨中，呈现 LFP 的高伽马功率与神经元的尖峰营谋高度联系。咱们的记实也显示器官和皮层通道都有高伽马周围的营谋（图 2e），这标明这些营谋由来于基层器官或皮层构造，而不是体积传导信号。总体而言，正在笼盖类器官的通道（图 2e，通道 1）和亲近视觉皮层的皮层通道（图 2e，通道 2）中能够了解地检测到视觉刺激的反响。移植后3周，器官样体显示出与周遭皮层相称幅度的LFP反响，这标明异种移植神经元与周遭皮层构造确立了突触衔接，并给与了来自幼鼠大脑的功效性输入。

　　接下来，咱们行使透后石墨烯微电极举行记实，研讨类器官细胞的尖峰营谋是否受周遭皮层神经营谋的调整。咱们评估了 0.5-3 kHz 带通滤波数据中的多单元营谋（MUA）。与高频 LFPs 一样，高频 MUA 信号被构造衰减得更厉害，于是紧要响应的是局限神经元发射（记实电极 100-200 µm 周围内）。图 3 显示了 MUA 记实。咱们采取了两个拥有代表性的通道（赤色，通道 O1 和 O4）笼盖类器官异种移植，两个通道（蓝色，通道 C2 和 C7）笼盖周遭皮层（图 3a）。正在整个通道中，咱们都阅览到了自愿的 MUA 事宜，这些事宜被界说为 MUA 跨过其规范过错 -3 至 -4 倍的预订阈值的时期点（图 3b）。自愿 MUA 事宜正在 8 到 11 周的试验中维系相对稳固，其尖峰率约为 2 Hz，与体表丈量的似乎老化有机体的营谋相似。为了验证 MUA 记实的空间定位和每个通道的独性情，咱们评估了事宜触发的 MUA 弧线。事宜触发 MUA 均匀值的盘算推算本领是：提取目的通道的 MUA 事宜时期，并盘算推算整个 16 个通道从目的通道事宜产生前 1 毫秒到产生后 2 毫秒的均匀 MUA 波形。假设类似的神经事宜被多个通道缉捕，那么邻近的几个通道就会展示似乎的 MUA 均匀值。而假设这些通道记实的是独立的神经营谋，那么 MUA 事宜偏转只会展示正在目的通道中，整个其他通道的均匀值都将为零。咱们的研讨结果标明，笼盖正在类器官或皮层上的每个通道记实到的 MUA 事宜都是局限的，并没有正在其他通道上展示任何扩散。正在对 1 毫秒分档后的通道间重叠事宜数目举行统计后，咱们呈现简直不存正在配合产生的事宜。类器官和皮层通道之间的 MUA 事宜重叠数正在统计学上并不明显，属于有时周围，这阐明 MUA 记实源自局限神经发射，于是笼盖类器官的电极记实是类器官神经元正在局限发作的，而不大概来自周遭的皮层通道。

　　图 3：类器官和皮层的多单元营谋。a 植入部位（赤色轮廓）和周遭皮层的显微照片。特出显示的是石墨烯微电极阵列的电极垫；通道 O1-O6 被界说为 “类器官通道”，而通道 C1-C7 被界说为 “皮质通道”。c 四个通道（O1、O4、C2 和 C7，以差异色彩显示）的事宜均匀 MUA 弧线的代表性示例（数据以均匀值 ± sdv 显示），显示自愿 MUA 事宜的空间定位。d 分为 1 毫秒的时程后，对各通道重叠事宜的计数显示简直没有重叠事宜。e 以 2 赫兹频率向对侧眼睛发出 4 秒一列的 100 毫秒光脉冲（黄域）的第一个脉冲时，整流 MUA 营谋的试验均匀值（6 次试验，数据以均值 ± sdv 显示）。f 通道 O4（类器官通道，上图）和通道 C7（皮层通道，下图）的均匀锁相值（PLV）与频率的干系。箭头指向刺激时刻（玄色）与无刺激时刻（灰色）比拟锁相值更高的频率区域。斑点显示 PLV 存正在明显区别（95% 诱导置信区间）的频率。g 通道 2 和通道 4 MUA 事宜时刻 5Hz LFP 信号相位的径向直方图。h 相位锁定空间周围的彩色图；两个通道的刺激诱导的 MUA 事宜显示出最切近视觉皮层的 theta 振荡的最强相位锁定（右下角）。星号显示行使瑞利轮回数据非平均性搜检（单侧），有刺激和无刺激（仅显示正在左图）的事宜之间的 p 0.05。d、f、g 和 h 的源数据以及 f 和 h 的无误 p 值行为源数据文献供给。所显示的结果代表总共三只动物的结果。

　　正在清楚记实中看到移植类器官对感到刺激的功效反响和对尖峰营谋的调整后，咱们接下来要问的是麻醉奈何影响类器官与周遭宿主皮层的自愿神经营谋。就像成人神经元整合到海马和嗅球已有的神经元搜集一律，咱们假设类器官异种移植最初给与的紧假使局限输入，而丘脑核和神经调整中枢等远间隔投射根本不存正在。因为麻醉已被阐明会影响大脑皮层的长程投射营谋，咱们假设异种正在麻醉状况下会显露出与宿主大脑皮层差异的营谋类型。正在此，咱们判辨了 1.5% 异氟醚麻醉诱导的以高 LFP 营谋期（突发）和相对冷静期（抑止）瓜代展示为特质的突发抑止形式。正在图 4 所示的植入 3 周后举行的代表性记实中，有 6 个通道被记号为笼盖类器官，8 个通道笼盖皮层。麻醉导致类器官与周遭皮层神经元营谋的裁减幅度更大，此中与长程神经调控联系的伽玛频段裁减幅度更大。与清楚状况比拟，麻醉状况下的归一化功率比显示出更大的反差，更加是更高频率的反差更为特出（图 4b）。与大脑皮层营谋比拟，类器官营谋较弱的缘故大概是缺乏胆碱能神经传导，而胆碱能神经传导与伽马营谋相闭。正在清楚状况下，类器官的营谋大凡低于周遭的皮层，对特定频段没有采取性（图 4e，f）。于是，类器官对麻醉和周遭皮层的反响是差异的。咱们的结果标明，类器官细胞的行径与成神经元似乎，它们与局限神经元神经安排，但缺乏长程投射。

　　图 4：动物清楚并用 1.5% 异氟醚麻醉时皮层和类器官自愿 LFPs 判辨。b 幼鼠麻醉（左）和清楚（右）时的均匀频带功率。频率功率归一化为皮层功率（设为 1），类器官功率显示为皮层功率的一局限（*p 0.05，双样本 t 搜检）。数据显示为均匀值 ± sdv（差错条），以及来自一只动物 16 个通道的单个数据点。Δ “代表 delta，”θ “代表 theta，”α “代表 alpha，”β “代表 beta，”Lγ “代表低伽马，”Hγ 代表高伽马。c 两秒的 LFP（低通滤波，250 Hz）历时显示了麻醉记实中的营谋发作。所示结果为五只动物的代表性结果。

　　为了研讨皮质类器官与周遭宿主构造的样子整合，搜罗宿主血管的造成，咱们行使了活体双光子成像和身后免疫染色。正在每次记实流程中，因为微电极的透后性，咱们行使明视野立体显微镜不受打击地查抄植入部位的宏观构造（如图 2a）。植入九到十周后，幼鼠正在打针血管内示踪剂 Alexa Fluor 680 右旋糖酐49 后给与双光子显微镜查抄。整个六只幼鼠的类区域都含有幼鼠血管。图 5a 显示了双光子成像的代表性结果。正在得到悉数曝光的低倍图（图 5a，左）后，咱们得到了植入区域（图 5a，中）和周遭皮层（图 5a，右）的高差别率 Z 叠加图。类器官的血管明晰可见，证据了与宿主皮质构造的整合。与咱们之前的研讨结果一律，类器官区域的血管密度低于周遭的皮层。

　　图 5：类器官血管化的活体成像和身后免疫组化判辨。a 正在打针血管内示踪剂 Alexa 680-Dextran 后，行使双光子显微镜（1240 纳米激起波长，512 × 512 像素，3 微米步长）获取的图像货仓的深度投影（0-650 微米）。总图（左）中类器官植入区域以赤色勾画，类部位（中）和幼鼠皮层（右）的血管显示出来。b 用 NM-95 抗体对 5 微米冠状切片举行免疫染色，检测人类核幼体。植入区域（中央）紧要包蕴人体细胞。c 用 CD31 抗体对 5 微米冠状切片举行免疫染色，检测内皮细胞。染色标明植入的类器官有血管造成（中心，箭头），但密度低于周遭的皮层（右边，箭头）。d 用 NeuN 抗体检测神经元核的免疫染色标明植入区域的细胞是神经元。请属意，与幼鼠神经细胞核（右侧，箭头）比拟，NeuN 抗体对人类神经细胞核（中心，箭头）的染色较弱。b-d 面板中显示的切片用苏木精（蓝色）举行反染；一抗用辣根过氧化物酶偶联二抗和二氨基联苯胺行为显色底物（棕色）举行检测。e 行使类器官内的 NeuN、NM-95、Ki67 和 Olig2 对类器官举行因素判辨，并与对侧皮质构造举行对比。数据以均匀值 ± sdv（差错条）与单个数据点并列显示，每个条形图判辨 n = 2 只幼鼠的六个切片区域。源数据行为源数据文献供给。显示的结果是反复的，而且对总共 5 只（b）、3 只（a）或 2 只（c、d）动物拥有代表性。

　　植入八到十一周后，动物被正法，用检测人类细胞（NM-95 抗体特异性检测人类核幼体）、内皮细胞（CD31）和神经细胞核（NeuN）的抗体对大脑举行构造学判辨。咱们正在整个动物中都呈现了 NM-95 阳性（即人类）细胞，并属意到差异动物的异种移植巨细存正在少少区别。图 5b 显示了一只动物 NM-95 染色后的代表性冠状切片。类区域的 NM-95 染色相当清楚，证据正在悉数试验流程中，人体细胞不断存活正在幼鼠皮质中。局限 NM-95 阳性细胞移除了植入部位（6 只幼鼠，图 5b 右）。检测到的人体细胞远离植入部位 4 毫米，沿着胼胝体转移（增加图 10）。正在染色为内皮细胞的相邻切片中（图 5c），咱们阅览到血管穿过异种移植物，这与咱们的活体双光子显微镜结果相似，显示了异种移植物的血管化。NeuN 与苏木精拉拢染色显示，正在结尾记及时，类中约 48% 的细胞拥有神经元表型（图 5d，e）。正在类器官区域检测到的 PSD-95 进一步证据了类器官细胞的神经元表型，PSD-95 是兴奋性神经元突触后密度记号（图 6）。对 NM-95、增殖细胞（Ki67）和少突胶质细胞（Olig2）的卓殊染色结果显示，类器官细胞由约 82% 的人类细胞、约 5% 的增殖细胞和约 7% 的少突胶质细胞构成（n = 3，图 5e）。

　　图 6：免疫荧光染色共聚焦显微镜下，正在幼鼠后 11 周举行结尾一次电心理记实后，对幼鼠器官样植入区域的人类核幼体（NM-95）、人类细胞质（STEM121）、突触素（Syn；突触前末了囊泡卵白）和突触后密度（PSD-95）举行免疫荧光染色。a 沿着类器官植入体（Org）和视觉皮层（Visual，箭头所指）的鸿沟（粉赤色划线），Syn（赤色）和 PSD-95（绿色）与人类细胞共定位。b 正在类器官植入体和后脾皮层（RSC）鸿沟（粉赤色划线）区域阅览到被 Syn、PSD-95 和幼鼠细胞（箭头）围困的人类细胞。c 阅览到被 PSD-95 和 Syn 围困的人类细胞（箭头）沿着胼胝体（CC）搬动。CC 和视觉皮层之间的鸿沟用粉赤色划出。属意 Syn 和 PSD-95 的密度较幼，这是胼胝体的特质，由于髓鞘轴突投射较长，突触末了较少。d Syn 阳性（绿色）和 hSyn 阴性（赤色）的突起被界说为幼鼠突触前末了。幼鼠突触前突触点的数目正在类器官植入体鸿沟较多（d，空心箭头），但正在植入体中央仍旧存正在（e，空心箭头）。f 人突触前终端的密度向类器官中央明显加多（上条形图，p = 0.0176），而幼鼠突触前终端（即 +Syn/-hSyn 点）的密度向类器官中央明显消浸（下条形图，p = 0.008）（*p 0.05，双样本 t 搜检）。数据以均匀值 ± sdv（差错条）与单个数据点并列显示，对一只幼鼠的 26 个脑区的 11,979 个 hSyn+ 和 Syn+ 点举行了判辨。源数据行为源数据文献供给。所显示的结果是两只动物的代表性结果。

　　结尾，为了研讨类器官和皮层之间的突触衔接，咱们对人类核幼体（NM-95）、突触前囊泡卵白突触素（Syn）和突触后密度（PSD95）举行了免疫荧光染色。正在图 6a-c 中，咱们沿移植器官（Org）和视觉皮层（Visual）的鸿沟（以粉赤色划出）、器官和后脾皮层（RSC）的鸿沟（以粉赤色划出）以及胼胝体（CC）内，检测了 Syn（赤色）和 PSD95（绿色）与人类细胞（白色）的共定位。咱们阅览到，正在幼鼠视觉皮层（图 6a，箭头所示）、后脾皮层（图 6b，箭头所示）和胼胝体（图 6c，箭头所示）的鸿沟处，器官样细胞与突触前、跋文号物清楚共定位，这标明突触拥有连通性。其余，咱们还研讨了类器官内的突触素是由来于幼鼠依旧人类，并通过尸检免疫荧光判辨评估了异种移植类器官与宿主幼鼠皮层之间的双向突触衔接。据咱们所知，目前还没有幼鼠特异性突触素记号物，于是咱们对人类细胞质（STEM121）、突触素和人类特异性突触素（hSyn）举行了三重染色（n = 2）。通过闭怀 Syn 和 hSyn 的重叠局限，咱们能够确定哪些突触前点状突触源自人类。其余Syn阳性而hSyn阴性的突触前点状物则被视为幼鼠突触前点状物。图 6d 和 e 诀别显示了距视觉皮层鸿沟 100 微米处和类器官中央的突触前点状突起和类器官内的神经元突起。咱们正在类器官鸿沟（图 6d）和中央（图 6e）阅览到幼鼠突触前点状突起（空心箭头）蚁合正在类器官突起邻近，这标明幼鼠神经元与类器官造成了突触前衔接。通过量化人和幼鼠突触前点状突触的密度，咱们阅览到幼鼠点状突触正在类器官鸿沟的密度清楚高于类器官中央，这大概是因为类器官亲近幼鼠皮质；而人的点状突触正在类器官中央的密度高于鸿沟，这大概是因为人的细胞正在样子上与幼鼠皮质整应时分裂所致（图 6f）。咱们还正在亲近类器官表缘的幼鼠视皮层中阅览到突触前点状细胞和 STEM121 染色。咱们正在类器官中阅览到的幼鼠突触前点状突触，以及正在幼鼠大脑皮层中阅览到的人类突触前点状突触，阐明正在结尾一次记及时，类器官和幼鼠视觉皮层一经确立了双向突触衔接。类器官中的幼鼠突触前点状突触为类器官对视觉刺激发作功效反响所需的突触衔接供给了证据，正如电心理记实中所阅览到的那样。

　　多伶俐细胞时间的最新希望使得从表周构造（如皮肤活检构造）平分袂出的hiPSCs可能天生神经元细胞系和皮质类器官。固然这些器官构造与人脑早期发育阶段的某些特质一样，但作育的器官构造缺乏自然的大脑微境况，会影响重编程神经元的表型和成熟。此前，咱们一经阐明，将人类皮质到成年幼鼠脑中会导致其进一步瓦解和血管化。正在本研讨中，咱们进一步胀动了这一模范，引入了光学透后石墨烯电极微阵列，可对移植体和周遭宿主神经元回途中的神经元营谋举行多形式纵向监测。这种修设使咱们可能查抄类器官与皮层的样子整合，并揭示类器官跟着时期的推移与内源性感到皮层的功效整合。假设行使古板的金属电极，咱们就无法正在不移除电极和捣蛋植入部位的处境下，得到明晰的视野来查抄类物和与感到皮层的切近水平。干细胞和神经记及时间的连系为研讨人类神经元搜集层面的功效波折、发育性脑病以及类器官奈何行为神经假体规复差异脑区的功效供给了机遇。

　　咱们的研讨结果标明，植入石墨烯微电极不会打击异种移植体的发育和血管化，况且能够通过光学成像（搜罗双光子显微镜）查抄 LFP 和 MUA 神经元营谋。诈骗这项时间，咱们阐理解器官构造对感到刺激的功效反响存正在若干区别。MUA事宜与更亲近视觉皮层的通道的LFP锁定，进一步阐理解人类神经元因为与幼鼠皮层造成了突触衔接而参预了对视觉刺激的搜集反响。试验均匀LFPs和自愿MUA尖峰的振幅也跟着时期的推移而加多，这标明类器官与微电极阵列的耦合取得了改观。正在行使 1.5% 异氟醚麻醉的处境下，咱们阅览到相对待周遭皮层，类器官营谋的伽玛功率采取性低浸。伽马营谋与胆碱能神经调整相闭。假设异种移植物的胆碱能神经安排低于大脑皮层，那么通过麻醉抑止胆碱能营谋将不行比例地消浸类器官相对待宿主大脑皮层的伽马功率。毕竟上，有研讨标明，成体神经元开始得到局限衔接，随后得到长程衔接。镇痛剂正在感化机造和对皮层营谋的影响方面存正在很大区别，研讨其他镇痛剂对异种移植器官的影响将是这一本领正在异日的兴趣使用。

　　咱们试验的告成取决于柔性透后石墨烯装配的工程安排。这种装配使咱们可能正在幼鼠大脑皮层中保存持久植入的微电极阵列，举行电心理记实，并能随时对部位举行成像。为此，咱们安排了一种带有维持表壳的轻型头柱组件，用于正在记实流程中通过 ZIF 衔接器将石墨烯阵列衔接到数据收罗编造。该组件将阵列与玻璃窗插入件统一正在一同，为持久植入的幼鼠供给了机器稳固性和耐用性。本研讨旨正在通过 11 周的体内记实和成像后，对异种移植举行构造学验证；异日还将举行更长时期的试验。这项时间的另一个异日生长对象是诈骗电极的透后性，连系钙成像时间阅览类器官神经元的尖峰营谋，或通过狂犬病毒逆行追踪类器官和幼鼠皮层之间的轴突投射，正如其他研讨职员正在体内iPSCs 和体表球体 中所阐明的那样。正在本试验举行时，这些本领尚未针对咱们的特定细胞系确立，但可正在异日开垦行使。

　　固然正在幼鼠大脑中移植人类皮质器官构造仍处于起步阶段，但咱们的研讨向这一世物模子编造的一切功效评估迈出了一步。咱们设念，正在异日的道途上，这种干细胞和神经记及时间的连系将用于正在心理前提下确立神经元回途层面的疾病模子，查抄患者特定遗传后台下的候选医疗本领，以及评估有机体正在整合后规复特定遗失、退化或受损脑区的潜力。

　　本研讨中描画的整个动物试验均服从美国国立卫生研讨院的《试验动物的看护和行使指南》举行，并得到了加州大学圣地亚哥分校动物看护和行使委员会（IACUC）的接受（合同 S14275）。免疫缺陷型非肥胖糖尿病（NOD）/告急拉拢免疫缺陷（SCID）幼鼠（6-8 周龄）购自杰克逊试验室（JAX Stock：001303）。本研讨行使的是 8-12 周龄的雌性幼鼠。幼鼠被喂养正在高压灭菌的笼子里，正在规范前提下（20-22 °C，40-60%相对湿度），光照/暗淡周期为 12 幼时，自正在进食和饮水。

　　头柱植入、开颅手术、类器官植入和石墨烯微电极阵列植入均正在一次手术中实行。手术前十二至二十四幼时，动物通过饮用水接受 0.53 毫克/毫升磺胺甲噁唑、0.11 毫克/毫升三甲氧苄啶和 40 毫克/毫升布洛芬。手术前四幼时，动物打针一次 4.8 毫克/千克（静脉打针）。麻醉时，动物给与 50 毫克/千克和 5 毫克/千克赛拉嗪的鸡尾酒麻醉，手术时刻辅以 0.1-1% 氧气异氟醚。麻醉诱导后，动物给与单剂量 0.05 毫克/千克丁丙诺啡（静脉打针）和 500 毫克/千克头孢唑啉（静脉打针）。切除皮肤后，洗刷骨骼，行使氰基丙烯酸酯胶水（VetBond）将皮肤与伤口鸿沟的骨骼衔接起来。然后，用 35% 磷酸凝胶（Kerr Dental）对颅骨举行 60 秒钟的蚀刻，再用无菌的 0.9% 氯化钠溶液洗净。然后，正在骨头上涂一薄层粘接剂（OptiBond，Kerr Dental），并用紫表线固化。头柱用牙科粘合剂（Tetric Evoflow）固定。为举行电心理记实，正在嗅球上植入一个参比电极（#000 微型螺钉），并用牙科粘合剂固定。然后，用牙科钻去除笼盖植入区域的一块直径为 3.5 毫米的圆形骨片。取出硬脑膜后，用抽吸法取出笼盖上丘的一大块直径约 1 毫米的后脾皮质（相对待 Bregma -3.5 毫米，相对待中线 毫米）。正在止住抽吸部位的出血后，将一个类器官置于空位内。将拥有 16 个通道的石墨烯微电极阵列粘合到由两块 3 毫米和一块 5 毫米盖玻片构成的玻璃塞上，并将其置于开颅手术的顶部，然后用牙科粘合剂（Tetric Evoflow）密封。

　　行使 Gamry Reference 600 恒电位仪正在 0.01 M 磷酸盐缓冲盐水（溶于去离子水的 Sigma-Aldrich P3813 干粉）中举行电化学阻抗谱判辨（EIS）。采用三电极摆设，Ag/AgCl 为参比电极，铂为对电极。正在开途电位下丈量了 100 kHz 至 1 Hz 的 EIS。悉数电极摆设编造被安插正在一个自造的法拉第笼中，以驱除噪音。

　　用 5%异氟醚对动物举行麻醉（诱导），并维系正在 1.5% 的浓度下举行支撑。正在麻醉状况下，固定动物头部，取下维持帽，将阵列衔接到记实装配上。正在麻醉状况下记实 5-10 分钟后，去除麻醉，让动物规复。约 10 分钟后，连接记实。10 分钟后，连接记实。

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　　将白光 LED 衔接到光纤电缆上，以供给光刺激。光源间隔动物和电心理记实修立约 1 米，以避免串扰和电噪声。光导纤维的顶端间隔动物的对侧眼睛约 3 毫米，以照亮悉数眼睛。以 1、2、5、10、15、55 和 85 Hz 的频率发出 5 至 100 毫秒的光脉冲（即光刺激），间隔时期为 1 至 5 秒，每次试验反复 10 至 20 次。刺激是通过定造的 MATLAB 代码驱动的 DAQ 编造来支配的。为了使刺激和记实同步，从 DAQ 编造向 Intan 记实编造发送刺激锁定触发信号。

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